PCR是一种用于制备数十亿份特异性PCR的方法DNA序列。
通常在分析DNA序列或长度时，需要比在典型样本中发现的特定DNA序列更多的副本。此外，PCR反应是高度特异性的，这意味着它只会从模板(样本)DNA中产生所需序列的副本。这种特异性是由引物来保证的，这些引物被设计成互补的，并退火到DNA感兴趣区域(靶区)的每一侧的特定区域。这些特点使PCR成为一种强大的技术，例如，在标记物的基因分型、测序之前，或在各种DNA测试中使用。
图1所示。PCR包括三个步骤:1。变性,2。退火,3。扩展。这些步骤重复了很多次(通常是30次)，产生了数十亿个特定区域的DNA拷贝
聚合酶链反应步骤
为了制备数十亿个DNA拷贝，在一个PCR管中要进行许多重复的DNA合成循环。每个循环包括由温度定义的三个不同步骤(图1)。所有的循环都是在不干预PCR机的情况下进行的，PCR机可以在每个步骤后自动改变温度。
- 变性步骤(95ºC):在这种高温下，将两条DNA链连接在一起的氢键会断裂，DNA链就会断裂。单链DNA现在可以复制了。
- 退火步骤(54ºC):在54°C时，称为引物的短DNA片段结合在模板DNA的互补位点上。引物定义了目标序列，也就是将要被复制的DNA的特定区域。退火温度根据引物的组成(核苷酸的数量以及鸟嘌呤和胞嘧啶的数量)计算。通常，你需要计算每个底漆的最佳退火温度。在这种情况下，我们认为所有底漆的退火温度为54℃。
- 扩展步骤(72ºC):在72摄氏度时，一种叫做DNA聚合酶的酶负责复制DNA。它识别与模板链结合的引物的3 '端并开始复制模板DNA。
在一个周期结束时，初始DNA链的部分数量增加了一倍。在PCR中通常进行的30个周期结束时，至少有10亿次(230.)目标序列的副本将出现在电子管中。为了进行PCR，您需要添加耐热DNA聚合酶、核苷酸、引物和您想要用作模板的DNA。
PCR试剂
PCR实验需要几种试剂;
- 引物:引物将结合在特定的DNA序列，标记DNA扩增的开始
- 核苷酸:核苷酸是构建新的DNA序列所必需的
- 聚合酶:聚合酶是一种根据模板序列组装核苷酸的酶
- DNA模板:模板是新的DNA序列扩增的基础
在准备PCR实验时，你必须格外小心潜在的污染。PCR是一种非常有效的DNA扩增技术。这意味着，如果你有一个微小的污染(例如，DNA来自其他样本)，这个DNA也可以被放大，与原始模板竞争，破坏你的实验结果。为了防止污染，您需要始终使用手套，并在非常干净的环境中工作(当您从不同的容器中移液时，请更换吸管头，扎好头发，不要在PCR工作台周围咳嗽或打喷嚏，等等)。
如上所述，PCR实验的误差很容易使结果发生偏差。这就是为什么我们需要最小化PCR的错误概率，特别是当我们继续使用另一种超敏感技术时，如下一代测序(NGS)．通常，NGS中的PCR步骤只包含10-12个循环。PCR步骤中产生的错误将显示为NGS数据比对中的不匹配，特别是早期PCR轮中的错误，它将在多次读取中显示，错误地暗示了样本中的遗传变异。