在涂层步骤之后，使用阻塞剂。这种因子是一种无关的蛋白质，不会干扰实验本身。它覆盖了微孔板孔中所有的不饱和表面结合位点，从而防止了在随后的实验步骤中蛋白质与微孔板的非特异性结合。非特异性结合可能导致假阳性．一个最佳的阻塞缓冲使信噪比最大化，重要的是它不与抗体或目标分子相互作用。

阻塞剂可以是蛋白质或洗涤剂(或肉汤)。常用的阻断剂有Tween 20(一种非离子洗涤剂)、脱脂干牛奶、明胶和牛血清白蛋白(BSA)。