CRISPR-Cas系统的分子机制是基于它的组件．为了使系统正常工作，需要满足两个重要条件:

• 与基因组的其他部分相比，目标序列应尽可能独特。

• 目标序列应该紧邻PAM序列

以下是主要步骤(图1):

1. gRNA和Cas蛋白在细胞质中形成核糖核蛋白(RNP)复合体，并在一种叫做Importin的蛋白质的帮助下进入细胞核。

2. RNP复合体在基因组中寻找特定的PAM序列。一旦它找到一个，gRNA将尝试从间隔gRNA的3'端向目标退火。如果在约10个碱基后，两个序列都正确退火，gRNA将像拉链一样继续在3'到5'的方向上。因此，非常重要的是，gRNA间隔序列(也称为种子序列)的前10个碱基与目标DNA相匹配，以允许切割。

3. 然后，Cas蛋白将利用其酶活性来修饰目标DNA。以最常用的Cas9为例，它会在给定的位点(通常在PAM序列上游的3-4个核苷酸左右)产生双链断裂，在两个DNA链中留下钝端。

图1所示。CRISPR-Cas机制。

一旦CRISPR-Cas修饰了目标DNA，修复途径就会被触发，即非同源端连接最活跃的一种，在使用CRISPR-Cas9的情况下，通常会导致敲除细胞的产生。