电压

每种微生物的电穿孔的电气条件各不相同。例如,酵母,例如酿酒酵母,具有40μl电池的最佳电气条件,约为5ms的1.5 kV。

细胞

电竞争细胞用于提高电穿孔效率。使用非离子溶液以去除所有盐,使酵母细胞通过洗涤使酵母细胞进行电动。此过程确保没有通过介质进行电荷。从中期或晚期阶段使用酵母时,可以实现酵母的最佳电穿孔。酵母对数阶段可以分为三个部分:

  • 早期阶段:细胞密度约为10的时期7细胞/mL。
  • 中间阶段:培养物的密度在1到5×10之间7细胞/mL。
  • 后期阶段:当细胞密度在5×10之间时发生7和2×108细胞/mL。

在对数阶段,生长速率很快,细胞分裂的速率超过了细胞死亡率。细胞是代谢活性的,并具有足够的基因组复制来进行有效的DNA修复。因此,在此阶段的细胞可以忍受诸如电穿孔之类的严厉处理。

脱氧核糖核酸

通过增加电穿孔缓冲液中的DNA浓度来增加转化的频率。但是,过多的DNA浓度也可以降低转化效率。必须确定每个实验的精确DNA浓度。

电穿孔介质

为了避免在电穿孔过程中弧形的样品,重要的是要彻底清洗电位电池以从细胞中清除生长培养基。可以用水或非离子溶液(例如葡萄糖,甘油,蔗糖,山梨糖醇或聚乙烯乙二醇)进行洗涤。离子材料的存在可能会在电穿孔过程中引起电弧。

最好使用山梨糖醇,因为它充当一种非腐烂的冷冻保护剂,可显着降低解冻过程中细胞膜损伤。膜的损伤显着降低了转化效率。

在电穿孔过程中,温度升高,细胞由于细胞外和细胞内大渗透性非平衡而导致的水流和外排造成的膜损伤。这种类型的损伤可以通过渗透稳定剂(例如山梨糖醇)来预防。因此,山梨糖醇充当冷冻保护剂和oSMolegulator。

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