荧光团中的电子被带到一个更高的能态，然后回落到基态(图1)，就会产生荧光。电子被带到激发态₂一种特定波长的光。电子失去了一部分能量，例如通过热量，然后又回到激发态₁．当电子从s轨道回落而失去剩余能量时，荧光就会发射出来₁到基态。发射出的光能量越低，意味着这种光的波长越长。

图1:特定波长的光的吸收导致荧光团中的电子被激发成s₂兴奋状态。电子损失了一些能量，例如通过热损失，然后回落到一个较低的能量，但仍然处于激发态s₁．当电子回落到基态时，荧光就会发射出来。发射的光能量越低，波长就越长。

在荧光显微镜下使用同一样品中不同的荧光团时，重要的是两个荧光团的发射光谱不明显重叠。如果是这样，在检测过程中可能无法区分这两个分子的信号。这就是所谓的渗透。