革兰氏染色是一个非常精细的过程，需要注意细节。不适当的涂片准备和染色技术常常产生错误的结果。

涂片制备

• 细菌涂片:如果涂片层过厚，革兰氏阴性菌颜色较深，可能被误认为革兰氏阳性菌。
  试着只应用你想研究的生物体的一层。

• 固着:固着过程中如果细菌过热，会破坏细胞壁，使细菌无法保留结晶紫。
  结果，所有的细菌都呈现革兰氏阴性。

• 过期的培养涂片:如果培养涂片太旧，细菌的细胞壁可能已经破裂，无法保留水晶紫染色。
  因此，所有的细菌都表现为革兰氏阴性。
  
  

染色

革兰氏染色中脱色常产生错误的结果。

• 脱色不足:如果酒精(脱色剂)在它对细胞壁有任何影响之前被洗去，结晶紫分子将不会逃脱革兰氏阴性细胞壁。
  结果所有细菌在番红花反染色后均呈革兰氏阳性(紫色)。
  

• 过度脱色:酒精(脱色剂)在玻片上停留太久会破坏革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁。
  革兰氏阳性菌不能保留结晶紫，故用番红花反染后，所有细菌均呈革兰氏阴性(粉红色)。
  

图1所示。Under-decolorization。Over-decolorization。