Extracción con tiocianato de guanidio y fenol-cloroformo - Labster Theory

Un método común utilizado para aislar el ARN total es la extracción con tiocianato de guanidio-fenol-cloroformo. En este método se utiliza un producto químico llamado TRIreagent (o TRIzol), que contiene isotiocianato de guanidinio, un potente desnaturalizador de proteínas, y fenol, un disolvente orgánico. El tampón TRIreagent mantiene la integridad de los ARN, desintegra las células y desnaturaliza las proteínas. Este método se basa en la investigación de Piotr Chomczynski y Nicoletta Sacchi en 1987 y 2006. Lleva un poco más de tiempo que los métodos basados en columnas como RNAeasy (Qiagen), pero permite manipular mayores cantidades de tejido o células y, por lo tanto, produce más ARN.

$Tubo de ensayo con fracciones etiquetadas de lisado de ARN después de la centrifugación. En el tubo de ensayo se observan dos capas distintas de líquido, la capa del fondo del tubo es roja y está etiquetada como la fase orgánica que contiene proteínas y lípidos. La capa superior es transparente y se denomina fase acuosa, y contiene el ARN. La superficie entre las fases se denomina interfase, que contiene el ADN.$

Los pasos principales del aislamiento de ARN son los siguientes:

Lisis celular y alteración de las estructuras celulares.
Separación del ARN de los restos celulares.
Purificación del ARN a partir del ADN y las proteínas.
Precipitación del ARN.
Lavado y resuspensión del ARN.

lisado胆固醇含量为mado por ARN, ADN, proteínas y restos celulares. Se puede utilizar la centrifugación para separar las macromoléculas (proteínas, ARN y ADN) de los restos celulares. La separación de fases de la muestra se producirá cuando se añada cloroformo a la muestra, en función de las diferentes densidades. Además, el pH determinará la separación de los ácidos nucleicos y las proteínas. El ARN polar permanecerá en la fase polar superior, el ADN se acumulará en la interfase y las proteínas desnaturalizadas se disolverán en la fase orgánica inferior.

El ARN de la fase acuosa se precipita añadiendo isopropanol, que precipita las moléculas polares como los ARN y las sales. Las sales pueden lavarse con etanol al 75 % para obtener ARN puro. Por último, el pellet de ARN se seca y se vuelve a suspender utilizando agua libre de ARNasa como tampón.

Tras el aislamiento de ARN, se debe medir laconcentración y purezadel ARN. También se debe comprobar lacalidad在realizar mas进行分析。