Prinzip
Ein Massenspektrometer ist ein analytisches Werkzeug, mit dessen Hilfe die molekulare Masse einer Probe gemessen werden kann. Die drei wichtigsten Teile eines Massenspektrometers sind die Ionenquelle, Analysator und Detektor. Ein Massenspektrometer funktioniert folgendermaßen:
- Es ionisiert die Probe.
- Es trennt diese Ionen nach Masse und Gewicht im Analysator.
- Es fragmentiert die ausgewählten Ionen und analysiert die Fragmente in einem zweiten Analysator.
- Es detektiert die Ionen, die vom letzten Analysator kommen und misst deren Häufigkeit mit dem Detektor, welcher Ionen in elektrische Signale umwandelt.
- Es bearbeitet die Signale vom Detektor, die an den Computer weitergeleitet werden und kontrolliert das Instrument durch Feedback.
MALDI
Es sind viele Ionisationstechniken verfügbar. Die am häufigsten genutzten sind: Elektrosprayionisation (EI) und Matrix-assistierte Laserdesorption/Ionisation (MALDI). In diesem Labor verwenden wir MALDI.
MALDI besteht aus zwei Schritten, in denen ein UV-Laser die Probe Ionisiert. Als erstes wird das zu analysierende Peptid in einer Matrix aufgelöst. Diese Matrix ist ein Lösungsmittel, das kleine organische Moleküle enthält. Die Moleküle zeigen bei der Wellenlänge des Lasers eine hohe Absorption. Die Mischung wird dann vor der Analyse getrocknet. Durch Trocknung entsteht eine Kristallmatrix, die das zu untersuchende Peptid enthält. In einem zweiten Schritt wird das Matrixmolekül in einen höheren Energiezustand versetzt, sobald es auf den UV-Laser trifft. Dabei entsteht ein Ion. Das ionisierte Molekül gelangt nun in den Analysator und das Massenspektrum wird gemessen.
TOF
Die MALDI-Ionisationsmethode ist an einen Analysator gekoppelt, der die Flugzeit analysiert (TOF). Im TOF wird die Zeit gemessen, die die Ionen benötigen, um den Detektor zu erreichen. Die Geschwindigkeit wird dann durch das Verhältnis von Masse/Ladung (m/z) bestimmt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor schneller, da sie weniger Masse besitzen. Die Ladung der Ionen bestimmt ebenfalls deren Geschwindigkeit. Ionen mit 2 oder mehr positiven Ladungen bewegen sich schneller als Ionen mit nur 1 positiven Ladung. Kleine, positiv geladene Ionen, bewegen sich also am schnellsten.
Die Ausgabe des Detektors ist das Massenspektrum, das als "Strichspektrum" dargestellt wird. Es zeigt die relative Ladung, die von den Ionen produziert wird.
Detektion von Proteinen
Proteine sind lineare Polymere, die unterschiedliche Kombinationen der 20 häufigsten Aminosäuren darstellen. Diese Aminosäuren sind durch Peptidbindungen miteinander verbunden. Das von den Ribosomen produzierte Protein durchläuft eine sogenannte post-translationale Modifizierung. Es wurden bisher über 200 Modifizierungen identifiziert.
Die Detektion von rhEPO erfolgt mit Hilfe eines Massenspektrometers. Das Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) entspricht ungefähr der Proteinmasse inDalton。我们verwenden一张Urinprobe苏珥Substanzdetektion. In den meisten Fällen ist es besser, eine Urinprobe statt eine Blutprobe zu untersuchen, um verbotene Substanzen nachzuweisen. Eine Urinprobe ist nicht invasiv und resultiert in einem höheren Probenvolumen und einer höheren Medikamentenkonzentration. Urin beinhaltet auch weniger Zellen und Proteine, welche die Extraktion erschweren.
Schaubild des Glykans, welches aus Monosacchariden aufgebaut ist
Um verbotene Substanzen im Urin zu detektieren, müssen wir als erstes ein Spektrum von nicht kontaminiertem Urin messen (Negativprobe), sowie ein Spektrum der verbotenen Probe (Positivprobe). Wenn wir diese beiden Kontrollproben gemessen haben, können wir sie mit dem Spektrum unserer Probe vergleichen. Wenn das Spektrum der Probe die gleichen Maxima wie die Positivkontrolle zeigt, dann können wir darauf schließen, dass die Probe die verbotene Substanz enthält. Massenspektrometrie kann auch dieGlykosylierungdetektieren, da die Daten vom Massenspektrometer verarbeitet und als Maxima dargestellt werden. Normalerweise werden die Maxima der Glykosylierung mit einem Stern oder einem Diagramm von Glykan markiert.
Histogramm im Labster-Labor
Klicke auf死数Schaltflache,嗯Daten de死去r Massenspektrometrie von rhEPO in CHO undE.colizu sehen. Es gibt drei Schaubilder:
Das Schaubild auf der linken Seite zeigt die Gesamtmasse des detektierten Moleküls. Die Maxima dieses Schaubilds korrelieren mit der molekularen Masse genau dieses Proteins.
Das obere rechte Schaubild zeigt die Übersicht der Peptidsequenz. Die Maxima in diesem Schaubild stellen jeweils eine Aminosäure in der Peptidsequenz dar.
Das untere rechte Schaubild zeigt die Vergrößerung der Peptidsequenz aus dem oberen Schaubild. Die Maxima in diesem Schaubild stellen jeweils eine Aminosäure in der Peptidsequenz dar. Das Diagramm des Glykans markiert die Stelle der Glykosylierung.