De manera similar a la técnica desecuenciación de primera generación, en el proceso de secuenciación de Illumina, basado en la secuenciación por síntesis, los nucleótidos se marcan de manera individual con tinte fluorescente.

• Se añade un nucleótido fluorescente, complementario a la secuencia de ADN que queremos identificar, y el alargamiento se detiene debido a un bloqueador en su terminal 3'.
• Se capturauna imagen para registrar el tinte/nucleótido.
• El bloqueo situado en el terminal 3' y que detiene el alargamiento se elimina químicamente del ADN, permitiendo que tenga lugar la adición del siguiente nucleótido.

La diferencia con la secuenciación de primera generación es que la secuenciación en paralelo produce millones de lecturas por ejecución, haciendo de este un método mucho más eficiente.

Para llevar a cabo un experimento de NGS, basado en secuenciación por síntesis, necesitas:

• Una muestra de ADN modificada con adaptadores.
• Nucleótidos modificados.
• T4 polimerasa.
• Una máquina de secuenciación de nueva generación.
• Realizar una generación de clústeres.

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