PCR（聚合酶链反应）

PCR是用于制备数十亿拷贝的特定DNA序列的方法。通常需要具有比典型样品中的特异性DNA序列的较多副本，以分析其基对序列或长度的DNA。此外，PCR反应是高度特异性的，这意味着它只能从模板（样品）DNA中产生所需序列的拷贝。该引物确保了这种特异性，该引物被设计成与感兴趣的DNA（目标区域）的每一侧的特定区域互补和退火。这些特征使PCR成为例如在测序之前或在各种DNA测试中进行标记的基因分型的强大技术。

图1。PCR由三个步骤组成：1。变性，2.退火和3.延伸。这些步骤重复多次（通常是30），产生数十亿个特定区域的DNA副本

PCR步骤

为了制备数十亿DNA拷贝，在一个PCR管中进行许多重复的DNA合成循环。每个循环包括由温度限定的三个不同步骤（图1）。在没有干预PCR机器的情况下进行所有循环，这可以在每个步骤后自动改变温度。

1. 变性步骤（95ºC）：在该高温下，将两个DNA链保持在一起的氢键被破裂，并且DNA链分开。单链DNA现在可用于复印。
2. 退火步骤（5-10ºC，底漆下方的引物）：在退火温度下，称为引物的短DNA片在模板DNA的互补位点处结合。引物定义靶序列，其是将被复制的DNA的特定区域。退火温度由引物组合物（核苷酸的数量以及鸟嘌呤和胞嘧啶的数量）计算。通常，您需要计算每个引物的最佳退火温度。在这种情况下，我们认为54°C作为所有引物的退火温度。
3. 延长步骤（72ºC）：在72ºC时，一种称为DNA聚合酶的酶负责复制DNA。它识别与模板链结合的引物的3'末端，并开始复制模板DNA。在这种情况下，它是一种热稳定的聚合酶，因为它需要在使用的高温下活跃。

在一个循环结束时，初始DNA链的部分数量增加了一倍。到末尾，例如，30个循环，这是通常在做PCR时进行的数字，至少10亿（2^30.）目标序列的拷贝将存在于管中。

PCR试剂

需要几种试剂进行PCR实验：

• 引物：引物将以特定的DNA序列结合并标记DNA扩增的开始。
• 核苷酸：需要核苷酸来构建新的DNA序列。
• 聚合酶：聚合酶是基于模板序列组装核苷酸的酶。
• 模板DNA：需要模板是新DNA序列扩增的基础。

在为PCR实验做好准备时，您必须仔细仔细潜在的污染。PCR是扩增DNA的一种非常强大的技术。这意味着如果您有一个微小的污染（例如，来自其他样本的DNA），则也可以扩增该DNA，与原始模板竞争并摧毁您的实验结果。为防止污染，您需要始终使用手套并在一个非常干净的环境中工作（例如，当您从不同的容器移液时更换移液器尖端，捆绑头发或不会在PCR工作台周围咳嗽或打喷嚏）。