PCR er en metode man kan benytte til at lave millioner af kopier af en specifik DNA sekvens. Man er nemlig ofte nød til at have en større mængde kopier af DNA’et for at kunne lave længde og/eller base-par analyse af sekvensen, i forhold til hvad der er at finde i den oprindelige prøve. Udover dette er PCR ufattelig specifik, dvs. man får kun produceret de sekvenser som man ønsker ud fra ens DNA prøve. Denne specificitet er opnået vedhjælp af primers, som er designet til at binde præcist til den region man gerne vil have flere kopier af. Disse ting gør PCR til et værdifuldt værktøj indenfor flere molekylære tests.
Trinene i en PCR
在kunne opna百万af kopier af窝ønskede DNA sekvensen, er man nød til at gennemgå utallige cykler i hver af sine PCR-rør. Hver cyklus inkluderer tre vidt forskellige trin, defineret ud fra deres temperatur (Figur 1). All trinene bliver udført i en PCR-maskine, som kan håndtere temperatur skiftene automatisk og dermed gøre arbejdet nemmere.
Denatureringstrinet (95oC) Ved denne høje temperatur, går hydrogenbindingerne der holder strengene sammen i stykker og dermed falder DNA strukturen fra hinanden. De enkelt strengede DNA strenge er nu klar til at blive kopieret
Annealingtrinet (54oC) DNA stykker kaldet primere binder sig til den komplementære del af skabelons(template) DNA’et. Primerne definerer den ønskede sekvens, hvilket er den specifikke region på template DNA-strengen man ønsker kopieret. Bindingstemperaturen(Annealing) bliver bestemt ud fra ens primer sammensætning(antallet af nukleotider, samt guanin og cytosin). Normalt er man nød til at udregne den optimale temperatur for hver primer, men vi går ud fra i dette forsøg at den er på 54oC.
Extensiontrinnet (72oC) Ved 72oC binder en specielt slags DNA-polymerase til template DNA’et, og påbegynder kopieringen. Den genkender 3’ enden af primeren, og starter kopieringen derfra, og påsætter nuklotider ud fra template DNA’strengen. Ved slutningen af den første cyklus, er antallet af DNA strenge blevet fordoblet. Ved slutningen af den 30. cyklus, som er det normale antal at bruge i en PCR, har man mindst 1 billion kopier af den ønskede sekvens. For at kunne kører en PCR skal man bruge en Thermo-stabil DNA-polymerase, nukleotider, primere og ens template DNA.
PCR reagenser
- Primers: Primers binder sig til et specifikt punk på DNA sekvensen, og markerer begyndelsen af DNA kopieringen.
- Nukleotider: Nukleotiderne er byggestenene for det ny DNA molekyle
- Polymerase: Polymerasen påsætter nukleotiderne på baggrund af ens template sekvens.
- Template DNA: Template DNA fungerer som skabelon for ens PCR. Der er her ens ønskede DNA sekvens kan findes.
Når man forbereder sig på at udføre en PCR, skal man være meget opmærksom på mulige kontamineringer. PCR er så effektivt til at kopiere specifikke DNA sekvenser, at hvis man får en lille smule DNA med fra en anden prøve vil DNA’en herfra også blive kopieret. Og dermed ødelægge ens oprindelige test. For at undgå kontaminering, er det vigtigt altid at bruge handsker, og arbejde i et sterilt område (Husk bl.a. Skift pipettespids hver gang du tager en ny prøve, sæt dit hår op og undgå at nyse og hoste nær PCR arbejdspladsen).