Die PCR ist eine Methode zur Herstellung von Milliarden von Kopien spezifischer DNA-Sequenzen. Für die Analyse einer spezifischen DNA-Sequenz werden oft mehr Kopien benötigt, als in einer typischen Proben gefunden werden können. Zudem ist die PCR-Reaktion sehr spezifisch, was bedeutet, dass sie nur Kopien der gewünschten DNA-Sequenz herstellt. Diese Spezifität wird durch Primer gewährleistet, die sich komplementär an beide Seiten der gewünschten DNA-Region anlagern (Target-Region). Diese Eigenschaften machen die PCR zu einer wichtigen Technik, beispielsweise für die Genotypisierung von Markern, vor der Sequenzierung oder in unterschiedlichen DNA-Tests.

Abbildung 1:Die PCR besteht aus drei Schritten: 1. Denaturierung, 2. Anlagerung und 3. Elongation. Alle diese Schritte werden viele Male wiederholt (oft mehr als 30x) und führen zu Milliarden von DNA-Kopien bestimmten Sequenz.

PCR-Schritte

Um Milliarden von DNA-Kopien herzustellen, werden viele DNA-Synthesezyklen in einem PCR-Röhrchen durchgeführt. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten, die von der Temperatur bestimmt werden (Abbildung 1). Alle Zyklen werden ohne Unterbrechung in einer PCR-Maschine durchgeführt, die die Temperatur automatisch verändern kann, um die unterschiedlichen Schritte einzuleiten.

1. Denaturierung (95ºC):这位hohen贝温了Wassersto死去ffbindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, aufgebrochen und die zwei Stränge getrennt. Die einzelsträngige DNA kann nun kopiert werden.
2. Anlagerung (54ºC): Bei 54°C binden kurze DNA-Stücke, die Primer, komplementär an die Template-DNA. Die Primer definieren die Target-Sequenz, die spezifische DNA-Region, die kopiert werden soll. Die Anlagerungstemperatur wird auf Grundlage der Primer-Zusammensetzung berechnet (der Anzahl der Nukleotide und die Anzahl der Guanine und Cytosine). Normalerweise würde man die optimale Anlagerungstemperatur für jeden Primer berechnen. In unserem Fall nehmen wir 54°C als die Anlagerungstemperatur
3. Elongation (72ºC): Bei 72 ºC ist ein Enzym namens DNA-Polymerase verantwortlich für die Kopie der DNA. Sie erkennt das 3′-Ende des Primers, der an ein Template gebunden hat und beginnt, die Template-DNA zu kopieren.

Am Ende eines Zyklus haben sich Teile der ursprünglichen DNA verdoppelt. Am Ende des 30. Zyklus liegen mindestens 1 Milliarde (2³⁰) Kopien der Target-Sequenz in unserem Probenröhrchen vor. Für die Durchführung einer PCR benötigst du eine hitzestabile DNA-Polymerase, Nukleotide, Primer und die DNA, die dir als Template dienen wird.

PCR-Reagenzien

Für die Durchführung eines PCR-Experiments werden mehrere Reagenzien benötigt;

• Primer:Primer werden an bestimmte DNA-Sequenzen binden und den Beginn der DNA-Amplifikation markieren.
• Nukleotide:Nukleotide werden benötigt, um die neue DNA-Sequenz zu bauen.
• Polymerase:Polymerase ist ein Enzym, das die Nukleotide auf Grundlage der Template-Sequenz zusammenbaut.
• Template-DNA:Ein Template wird als Grundlage für die Amplifikation der DNA-Sequenz benötigt.

Wenn man ein PCR-Experiment vorbereitet, muss man vor allem auf mögliche Kontaminationen achten. Die PCR ist eine mächtige Technik zur Amplifikation von DNA. Das bedeutet, dass wenn auch nur eine winzige Kontamination vorliegt (beispielsweise die DNA einer anderen Probe), wird auch diese DNA amplifiziert und konkurriert mit dem originalen Template, was dein Ergebnis zerstört. Um eine Kontamination zu vermeiden, musst du immer Handschuhe tragen und sauber arbeiten (die Pipettenspitzen wechseln, wenn du aus einem anderen Behältnis pipettierst, dein Haar zusammenbinden, nicht husten oder niesen, usw.)

Primerdesign für direkte Klonierung

Um PCR-Produkte zu erzeugen, die direkt in ein Plasmid kloniert werden können, müssen Restriktionsstellen an beiden Enden des PCR-Produkts hinzugefügt werden. Diese Restriktionsstellen können mit einem Primerpaar mit einer spezifischen Restriktionsstelle am 5'-Ende hinzugefügt werden. Jeder Primer enthält eine Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine Hybridisierungsstelle am 3'-Ende. Zur Auswahl der richtigen Restriktionsstelle kann die [Restriktionsstellentabelle] (wiki:/Restriction_enzyme-de) herangezogen werden. Die gewählte Restriktionsstelle muss diese Anforderungen erfüllen:

1. Restriktionsenzyme, die nicht im RAD52-Gen schneiden.
2. Restriktionsenzyme,努尔der MCS(多克隆死去ing site) auf dem Zielplasmid schneiden.
3. Restriktionsenzyme, die die gleichen optimalen Puffer- und Temperaturbedingungen haben.

Die folgenden Schritte sind zu beachten, um einen Primer zu erstellen:

Vorwärtsprimer

1.Wähle 18-22 bp am Anfang der Sequenz des Gens von Interesse (vergewissere dich, dass es die Anforderungen für einen guten Primer erfüllt).

1. Füge die Restriktionsstellen-Sequenz am 5'-Ende hinzu.

Rückwärtsprimer

1.Wähle 18-22 bp am Ende der Sequenz des interessierenden Gens (vergewissere dich, dass sie die Anforderungen an einen guten Primer erfüllt).

1. Reverskomplementiere die gewählte Sequenz.

2. Füge die Restriktionsstellen-Sequenz am 5'-Ende hinzu.

DNA-Isolation

Gelelektrophorese

Theorie im Überblick