La PCR es un método utilizado para preparar miles de millones de copias de secuencias específicas de ADN. Con frecuencia, es necesario tener una mayor cantidad de copias de la secuencia específica de ADN que aquella que se encuentra en una muestra típica, para así analizar el ADN por su secuencia de pares de bases o longitud. Además, la reacción de PCR es muy específica, lo que significa que solo producirá copias de una secuencia deseable a partir del ADN molde (muestra). Esta especificidad se garantiza por medio de los cebadores, diseñados para ser complementarios y para hibridarse en regiones específicas a cada lado de la región de ADN de interés (región diana). Estas características convierten la PCR en una potente técnica, por ejemplo, en la genotipificación de marcadores, antes de la secuenciación o en múltiples pruebas de ADN.
Pasos de la PCR
Para preparar miles de millones de copias de ADN, se realizan muchos ciclos repetidos de síntesis de ADN en un tubo de PCR. Cada ciclo incluye tres pasos distintos, definidos por la temperatura (Figura 1). Todos los ciclos se realizan sin intervención en una máquina de PCR, que puede cambiar automáticamente la temperatura para dar lugar a estos pasos:
- Paso de desnaturalización (95 ºC): a estas altas temperaturas, los enlaces de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de ADN se rompen y las cadenas de ADN se separan. El ADN monocatenario ya está listo para realizar la copia.
- Paso de hibridación (54 ºC): a 54 grados Celsius, unos trocitos de ADN llamados cebadores se unen a sitios complementarios del ADN molde. Los cebadores definen la secuencia diana, que será la región específica del ADN a copiar. La temperatura de hibridación se calcula a partir de la composición (el número de nucleótidos, así como el número de guaninas y citosinas). Normalmente, tendrías que calcular la temperatura óptima de hibridación para cada cebador. En este caso, tenemos en cuenta los 54 grados Celsius como referente en la hibridación.
- Paso de extensión (72 ºC): A 72 grados Celsius, una enzima llamada ADN polimerasa es responsable de copiar el ADN. Esta reconoce el extremo 3' de la unión de un cebador a una cadena molde y empieza a copiar el ADN molde.
Hacia el final de un ciclo, algunas partes de las cadenas de ADN inicial se han multiplicado por dos. Hacia el final de, por ejemplo, 30 ciclos, que son los que se suelen realizar en la PCR, al menos mil millones (230) de copias de la secuencia diana estarán presentes en el tubo. Para realizar una PCR, tienes que añadir una ADN polimerasa termoestable, nucleótidos, cebadores y el ADN que quieras utilizar como molde.
Reactivos de la PCR
- Cebadores: Los cebadores se unirán a una secuencia específica de ADN y marcarán el inicio de la amplificación de ADN.
- Nucleótidos: Se necesitan nucleótidos para construir una nueva secuencia de ADN.
- Polimerasa: La polimerasa es una enzima que ensambla los nucleótidos según la secuencia molde.
- ADN molde: Se necesita un molde como base para una nueva amplificación de secuencia de ADN.
Cuando te prepares para una experimento de PCR, tienes que tener mucho cuidado de no contaminar nada. La PCR es una técnica muy potente para amplificar ADN. Esto quiere decir que, si cometes una pequeña contaminación (por ejemplo, ADN procedente de otra muestra), ese ADN puede amplificarse, compitiendo con el molde original y arruinando los resultados de tu experimento. Para prevenir contaminaciones, siempre tienes que utilizar guantes y trabajar en un entorno muy limpio (cambia las boquillas de pipeta cuando extraigas contenido de un recipiente diferente, recógete el pelo, no tosas o estornudes alrededor de la mesa de laboratorio de la PCR, etcétera).