En el caso de laPCR cuantitativa, es muy importante evitar que se produzcan dímeros de cebador y otros productos de PCR no específicos, ya que estos incorporarán fluorocromos, lo cual hará que obtengamos unacuantificación de la PCR cuantitativainexacta en los experimentos. Además de lasconsideraciones habituales para diseñar cebadores, hay otras directrices importantes que se deben tener en cuenta para diseñar los cebadores para una PCR cuantitativa:

1) Elige cebadores que den un producto (amplicón) de 100-200 pb (lo óptimo serían 100 pb). La PCR funciona de manera óptima con amplicones pequeños, de ese tamaño aproximado. Los cebadores deben tener una longitud de alrededor de 20 pb.

2) Si es posible, diseña cebadores que cubran las fronteras entre exones (en dos exones distintos) para detectar una posible contaminación del ADN. Pero ten cuidado: estos cebadores podrían detectar algunas variantes de empalme y no otras. Si no se puede realizar este diseño, es muy importante tratar la muestra de ARN con ADNasa antes de la transcripción inversa.

3) Comprueba que las secuencia de los dos cebadores no sean demasiado complementarias para evitar que se unan entre ellos y formen dímeros de cebador.