Los cebadores son fragmentos cortos de ADN que se utilizan para iniciar la copia del ADN mediante la enzimaADN polimerasaen unareacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cebadores suelen tener una longitud de entre 18 y 25 nucleótidos y se unen (aparean) a una región complementaria de un ADN monocatenario, denominada hebra molde. Cuando se une un cebador, la polimerasa también puede unirse al ADN en el extremo 3' del cebador (figura 1). Después de unirse al extremo 3' del cebador, la ADN polimerasa copiará la hebra molde de ADN.
Figura 1:Descripción esquemática del papel de los cebadores durante la síntesis de ADN.
Diseño de imprimación
Si nos dan una pieza de ADN, como se muestra a continuación, y quisiéramos diseñar cebadores que amplificaran toda esta región en una reacción de PCR, tendríamos que colocar los cebadores en cada extremo de la secuencia. Las regiones del cebador se muestran en negrita en la secuencia siguiente:
La ADN polimerasa solo puede añadir nucleótidos al extremo 3' de una hebra de ADN. Debido a que los cebadores son los «puntos de partida» de las nuevas hebras de ADN producidas por la polimerasa, tenemos que asegurarnos de que los extremos 3' de nuestros cebadores apunten en la dirección correcta, para que se copie la secuenciaentrelos dos cebadores y no la que quedafuera嗨。科莫las凯德nas de ADN son antiparalelas, los cebadores tienen que unirse a diferentes cadenas. Esto se muestra a continuación:
Una vez que hemos localizado la ubicación de los cebadores, tenemos que determinar la secuencia. Podemos observar la secuencia a la que los cebadores necesitarán aparearse (unirse) y, por lo tanto, las secuencias de los cebadores deben ser complementarias a las cadenas a las que se unen. Los cebadores suelen tener una longitud de entre 18 y 25 bases. Aquí, vamos a diseñar cebadores de 20 bases. El cebador izquierdo (cebador 1) se denominaforward(en inglés, hacia adelante) y el derecho,reverse(en inglés, hacia atrás).
En realidad, hay más factores en juego cuando diseñamos cebadores. Por ejemplo, hay que evitar la formación de dímeros, lo que implica que los cebadores se unen a sí mismos en lugar del ADN monocatenario. Además, la temperatura de fusión de los cebadores determina la estabilidad del conjunto del molde ADN y el cebador. Por suerte, se han desarrollado muchos programas que tienen en cuenta estos parámetros y que diseñan los cebadores cuando se les da una secuencia de entrada (la secuencia que queremos amplificar).
La longitud del producto de la PCR está determinada por los cebadores
La longitud de un producto de PCR está determinada por la colocación de los cebadores. En la siguiente figura, seguimos una sola hebra y observamos cómo la colocación del cebador acorta la longitud del fragmento a través de múltiples rondas de replicación (se requieren tres rondas para obtener el primer fragmento de doble hebra donde ambas hebras tienen la longitud de los cebadores).
En una reacción de PCR, los cebadores se eligen de manera que enmarquen la secuencia que queremos copiar, lo que también determina la longitud del fragmento resultante. Los cebadores se incluyen en el producto de PCR.