I primer sono brevi sequenze di DNA utilizzate per avviare la replicazione del DNA da parte dell'enzimaDNA polimerasiin unareazione a catena della polimerasi (PCR). Solitamente hanno una lunghezza di 18-25 nucleotidi e si legano (appaiano) alla regione complementare di un DNA a singolo filamento, chiamato filamento stampo. Quando un primer è legato, anche la polimerasi può legarsi al DNA all'estremità 3' del primer (Figura 1). Dopo di che, la DNA polimerasi procede a copiare il filamento stampo di DNA.

Figura 1: Panoramica schematica del ruolo dei primer durante la sintesi del DNA

Progettazione dei primer

Se ci viene data una sezione di DNA, come mostrato qui sotto, e volessimo progettare dei primer che amplifichino questa intera regione in una reazione PCR, dovremmo posizionare i primer a ogni estremità della sequenza. Le regioni dei primer sono mostrate in grassetto nella sequenza qui sotto:

La DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3' di un filamento di DNA. Poiché i primer sono i "punti di partenza" dei nuovi filamenti di DNA creati dalla polimerasi, dobbiamo assicurarci che le estremità 3' dei nostri primer puntino nella giusta direzione, in modo che venga copiata la sequenzatrai due primer, e non la sequenzalontanadai primer. Poiché i filamenti di DNA sono antiparalleli, i primer devono legarsi a diversi filamenti, come mostrato qui sotto:

Ora che abbiamo individuato il posizionamento dei primer, dobbiamo solo determinarne la sequenza. Possiamo osservare la sequenza a cui i primer dovranno legarsi: le sequenze di primer devono essere complementari ai filamenti a cui si legano. I primer sono tipicamente lunghi 18-25 basi. In questo caso, progetteremo primer di 20 basi. Il primer di sinistra (primer 1) è normalmente chiamato primer forward (fv), e quello di destra è il primer reverse (rv).

In realtà, ci sono più fattori da considerare quando si progettano i primer. Per esempio, vogliamo evitare la formazione di dimeri, ovvero che i primer si leghino a se stessi invece che al DNA a singolo filamento. Inoltre, la temperatura di fusione dei primer determina la stabilità del DNA stampo/duplex primer. Fortunatamente, sono stati sviluppati svariati programmi che prendono in considerazione questi parametri e progettano i primer in base alla sequenza di input fornita (la sequenza che si desidera amplificare).

La lunghezza del prodotto PCR è determinata dai primer

La lunghezza di un prodotto PCR è determinata dal posizionamento dei primer. Nella figura qui sotto seguiamo un singolo filamento e osserviamo come il posizionamento dei primer accorcia la lunghezza del frammento attraverso più cicli di replicazione (sono necessari tre cicli per ottenere il primo frammento a doppio filamento dove entrambi i filamenti hanno la lunghezza dei primer).

La lunghezza di un prodotto PCR è determinata dal posizionamento dei primer (Figura 2).

Figura 2: Legame dei primer ed estensione del filamento di DNAUn singolo filamento di DNA viene copiato e accorciato attraverso molteplici cicli di replicazione a causa del legame di primer specifici (sono necessari tre cicli per ottenere il primo frammento a doppio filamento dove entrambi i filamenti hanno la lunghezza dei primer).

In una reazione PCR, i primer sono scelti in modo da inquadrare la sequenza desiderata. Questo determina anche la lunghezza del frammento risultante, e i primer sono inclusi nel prodotto finale della PCR. La figura a destra mostra come un singolo filamento viene accorciato alla lunghezza desiderata del prodotto PCR attraverso diversi cicli di replicazione diretti dai primer specifici del sito.