La fosforilazione si riferisce all'aggiunta di un gruppo fosfato. Nel caso della fosforilazione a livello di substrato, il gruppo fosfato viene rimosso da un reagente intermedio nella via metabolica, e l'energia libera della reazione viene utilizzata per aggiungere un terzo fosfato a una molecola di ADP disponibile, producendo ATP (vedi immagine sotto).

Nellarespirazione cellularequesto avviene durante laglicolisie ilciclo di Krebs.

Nelle reazioni di fosforilazione a livello di substrato, il gruppo fosfato di un reagente intermedio viene trasferito a una molecola di ADP per sintetizzare ATP.