Un método común de aislamiento del ARN total es la extracción con una mezcla de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo. Este método utiliza un TRIreagente (o TRIzol), que contiene tiocianato de guanidinio, un potente desnaturalizante de proteínas, y fenol, un disolvente orgánico. La solución tampón de TRIagente mantiene la integridad de los ARN, rompe las células y desnaturaliza las proteínas. Este método se basa en los trabajos de Piotr Chomczynski y Nicoletta Sacchi, realizados en 1987 y 2006. Lleva algo más de tiempo que los métodos en columna, como el RNAeasy (Qiagen), pero es capaz de procesar cantidades mayores de tejido o células y, consecuentemente, dar como resultado más ARN.
Los principales pasos del aislamiento del ARN son los siguientes:
- Lisis celular y rotura de las estructuras celulares
- Separación del ARN de los desechos celulares
- Purificación del ARN del ADN y las proteínas
- Precipitación del ARN
- Lavado y resuspensión del ARN
El lisado se compone de ARN, ADN, proteínas y desechos celulares. Se puede utilizar la centrifugación para separar las macromoléculas (proteínas, ARN y ADN) de los desechos celulares. La separación de fases según la densidad de la muestra ocurrirá al añadir cloroformo a esta. Además, el pH determinará la separación de los ácidos nucleicos y las proteínas. El ARN polar permanecerá en la fase polar superior, el ADN se acumulará en la interfase y las proteínas desnaturalizadas se disolverán en la fase orgánica inferior.
El ARN de la fase acuosa se precipita al añadir isopropanol, que precipita las moléculas polares como los ARN y las sales. Las sales pueden lavarse con etanol al 75 % para obtener ARN puro. Por último, el pellet de ADN se seca y se resuspende, utilizando agua libre de ARNsa como solución tampón.
Tras el aislamiento del ARN, hay que evaluar suconcentración y pureza. Además, hay que inspeccionar lacalidadantes de continuar el análisis.