用户克隆方法中涉及三种主要酶：

• 高保真DNA聚合酶：在PCR中放大含尿嘧啶的DNA。市场上的可用酶是基于PFU DNA聚合酶的转基因改进的DNA聚合酶，其最初是发现的Pyrococcus furiosus.。由于其优异的热稳定性和校对性能，该酶用于用户克隆，这确保了PCR产物中的误差而不是使用其它聚合酶。一些示例是p​​futurbo cx hotstart，pfux7或phusion u hotstart。

• 尿嘧啶DNA糖基糖苷：切割尿嘧啶和核糖之间的糖苷键。由于尿嘧啶和腺嘌呤之间的氢键弱化，其作用导致从DNA链中除去尿嘧啶。

• 内核酸酶VIII：识别尿嘧啶DNA糖基糖基酶的作用后留下的脱脂遗址，在DNA单链上切割磷酸二酯键。这促进了由于剩余的氢键的弱化而去除上游DNA序列，从而产生3'突出的产生。