利用特异性抗体可以检测出感兴趣的蛋白质。在将抗体应用到细胞膜上之前，要加入一种阻断溶液，通常是5%的牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉，以防止非特异性蛋白质结合。

通常在Western blot中使用两种抗体:一抗和二抗。初级抗体有一个独特的结合位点，可以识别特定的蛋白质。在膜与一抗孵育后，将未结合的一抗洗去，加入二抗。二级抗体将选择性地与一级抗体结合。二抗不仅作为检测标签的载体，而且作为发射信号的放大器。二抗的标签通常是生物素或报告酶，如碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)。

图1所示。蛋白质检测使用抗体。

具有不同标记系统的二抗种类繁多，可在四种检测系统中使用:比色法、化学发光法、放射性和荧光法。

和所有的实验一样，添加实验对照是很重要的。在Western blot中，这是为了检测是否加入了相同数量的样品，从而确保结果是否可以进行比较。最常见的控制是肌动蛋白。这种蛋白在所有细胞中都有高水平表达，可以在Western blot上可靠地观察到。