根据蛋白质是细胞外的还是细胞内的，有不同的样品制备方法。细胞内蛋白质更难提取，提取过程必须仔细设计。

图1所示。Western Blot样品制备。

每个有机体的细胞组成都是由复杂的分子混合物组成的，包括蛋白质、核酸、多糖和盐。这些分子可能干扰Western blot方法，因此样品制备的重要性。有许多细胞破坏的方法来制备用于Western blotting的样品。通常在处理哺乳动物细胞时，可以通过洗涤液裂解、冷冻/解冻裂解或机械均质和超声去除细胞膜。

提取后，将蛋白质样品在含有示踪染料(溴酚蓝)、二硫还原剂(β -巯基乙醇)和洗涤剂(十二烷基硫酸钠/ SDS)的溶液中煮沸。沸腾使蛋白质变性，从而展开。巯基乙醇阻止了二硫键的重组，从而破坏了蛋白质的四级和三级结构，形成了线性链多肽。十二烷基硫酸钠用一个负电荷限制蛋白质。