新一代测序
“下一代测序”是一项先进的测序技术，可以同时对数百万个DNA短分子进行测序。这项技术也被称为大规模并行测序。
有许多不同的下一代测序平台:每一个使用不同的技术。在这种情况下，我们将专注于Illumina采用的可逆染料终止技术。首先，DNA被分割，两个短的DNA分子(称为适配器)被连接到每个序列的两端(见图2)。这些适配器作为PCR的引物-对接位点，并连接到流动细胞上。
DNA分子的适配器首先附着在一个载玻片(称为流动细胞)，然后被聚合酶放大，形成局部克隆DNA菌落。这些DNA集落也被称为DNA簇。每个DNA簇包含完全相同的DNA序列，因此称为克隆DNA簇。与第一代测序技术相似，核苷酸用荧光染料单独标记。添加一个核苷酸后，延伸停止并拍照。然后，位于3'端的阻断剂被化学方法从DNA中移除，从而进行下一个核苷酸加成循环。
一旦DNA被提取出来，就需要为测序做准备。不同的样品制备步骤概述如下:
- 碎片
- End-repair
- 撤离
- 适配器结扎
- PCR扩增
- 然后是集群的生成和实际的排序过程。
通过将reads的序列与参考序列进行比较，这些reads被组装起来。reads的重叠允许原始DNA片段的重建。
并行排序每次运行产生数百万次读取。这比第一代测序产生的读数指数大。下一代测序是一项非常强大的技术，可用于许多不同的应用，如SNP分析、基因表达分析和基因畸变(如突变或染色体重排)的检测。
在这种情况下，我们想要识别蛋白质编码序列;因此我们可以排除除信使RNA以外的所有RNA物种。相关序列包含一个开始密码子，接着是几百个密码子，然后是一个停止密码子。