cDNA(互补DNA)与mRNA互补，由逆转录酶(RT)从mRNA模板合成。由于它是基于mRNA, cDNA只包含基因的表达部分，而基因组DNA包含整个基因序列。

当研究基因组的蛋白质编码区域时，与mRNA的工作提出了一些挑战。最重要的是，由于无处不在的RNA酶，RNA很容易降解。因此，从mRNA反转录到cDNA，为分析基因组的这一部分创造了一个更稳定和可靠的样本，例如PCR。最重要的是,聚合酶链反应基于测序和qPCR涉及到DNA聚合酶的使用，它可以使用cDNA而不是mRNA作为底物。

用于mRNA合成cDNA的引物通常是oligo(dT)引物，它能够吸附在mRNA分子的聚a尾部。随机六聚体引物有时也被使用，这取决于六聚体的序列，它会随机结合到样本中的任何RNA，这取决于六聚体的序列。cDNA合成后，DNA-RNA杂交就形成了。最后，RNA被RNaseH消化，产生单链cDNA分子，可以直接用于任何基于pcr的技术。如果需要双链cDNA，产生的单链DNA可以折叠，3'端与同一条链上的互补序列结合。产生的双链DNA作为DNA聚合酶的引物，产生互补链。

当逆转录从组织样本中分离出来的mRNA时，所有的mRNA分子都被转录。因此，如果mrna的拷贝量非常高(由于基因的高表达)，就会产生cDNA的拷贝量非常高。同样，未表达的基因，即转录的mRNA拷贝很少或没有的基因，也不会出现在cDNA样本中。