Estrazione mediante fenolo-cloroformio-tiocianato di guanidinio - Labster Theory

联合国metodo只有utilizzato每isolare l 'RNA完全的le è l'estrazione di guanidio tiocianato-fenolo-cloroformio. Questo metodo utilizza una sostanza chimica chiamata TRIreagent (o TRIzol), che contiene isotiocianato di guanidinio, un potente denaturante proteico, e fenolo, un solvente organico. Il tampone TRIreagent mantiene l'integrità dell'RNA, distrugge le cellule e denatura le proteine. Questo metodo si basa sulla ricerca di Piotr Chomczynski e Nicoletta Sacchi del 1987 e 2006. Richiede un po' più di tempo rispetto ai metodi basati su colonne come RNAeasy (Qiagen), ma può gestire grandi quantità di tessuto o cellule e quindi produce più RNA.

Provetta con frazioni marcate di lisato di RNA dopo centrifugazione. Nella provetta si possono vedere due distinti strati di liquido, lo strato sul fondo della provetta è rosso ed etichettato come fase organica che contiene proteine e lipidi. Lo strato superiore è trasparente ed etichettato come fase acquosa, contiene l'RNA. La superficie tra le fasi è etichettata come interfase, che contiene DNA.

Le fasi principali dell'isolamento dell'RNA sono le seguenti:

Lisi cellulare e distruzione delle strutture cellulari.
Separazione dell'RNA dai detriti cellulari.
Purificazione dell'RNA dal DNA e dalle proteine.
Precipitazione dell'RNA.
Lavaggio e risospensione dell'RNA.

Il lisato è costituito da RNA, DNA, proteine e detriti cellulari. La centrifugazione può essere utilizzata per separare le macromolecole (proteine, RNA e DNA) dai detriti cellulari. La separazione di fase del campione si verificherà quando il cloroformio viene aggiunto al campione, in base alle diverse densità. Inoltre, il pH determinerà la separazione degli acidi nucleici e delle proteine. L'RNA polare rimarrà nella fase polare superiore, il DNA si accumulerà nell'interfase e le proteine denaturate si dissolveranno nella fase organica inferiore.

L'RNA della fase acquosa viene precipitato aggiungendo isopropanolo, che fa precipitare molecole polari come RNA e sali. I sali possono essere lavati via con etanolo al 75% per ottenere RNA puro. Infine il pellet di RNA viene essiccato e risospeso utilizzando acqua priva di RNAsi come tampone.

Dopo l'isolamento dell'RNA è necessario valutare laconcentrazione e purezzadell'RNA. Anche laqualitàdovrebbe essere controllata prima di effettuare ulteriori analisi.