联合国metodo缩写utilizado对位aislar el攻击es la extracción con tiocianato de guanidio y cloroformo. En este método se utiliza un producto químico llamado TRI Reagent (o TRIzol), que contiene isotiocianato de guanidinio, un potente desnaturalizador de proteínas, y fenol, un disolvente orgánico. El tampón TRI Reagent mantiene la integridad de los ARN, desintegra las células y desnaturaliza las proteínas. Este método se basa en la investigación de Piotr Chomczynski y Nicoletta Sacchi en 1987 y 2006. Lleva un poco más de tiempo que los métodos basados en columnas como RNeasy (Qiagen), pero puede procesar mayores cantidades de tejido o células y, por lo tanto, produce más ARN.
Los principales pasos del aislamiento del ARN son los siguientes:
- Lisis celular y disrupción de las estructuras celulares.
- Separación del ARN de los restos celulares.
- Purificación del ARN del ADN y las proteínas.
- Precipitación del ARN.
- Lavado y resuspensión del ARN.
El lisado está formado por ARN, ADN, proteínas y restos celulares. La centrifugación puede utilizarse para separar las macromoléculas (proteínas, ARN y ADN) de los restos celulares. La separación de fases de la muestra se producirá cuando se añada cloroformo a la muestra, en función de las diferentes densidades. Además, el pH determinará la separación de los ácidos nucleicos y las proteínas. El ARN polar permanecerá en la fase polar superior, el ADN se acumulará en la interfase y las proteínas desnaturalizadas se disolverán en la fase orgánica inferior.
El ARN de la fase acuosa se precipita añadiendo isopropanol, que precipita las moléculas polares como los ARN y las sales. Las sales pueden lavarse con etanol al 75 % para obtener ARN puro. Finalmente, el pellet de ARN se seca y se vuelve a suspender utilizando agua libre de ARNasa como tampón.
Después de aislar el ARN, es necesario evaluar laconcentración y purezadel ARN. También se debe evaluar lacalidadantes de continuar con el análisis.