之后集群生成，我们准备开始测序过程。有几种不同的表演方式下一代测序，取决于您使用的平台。在这个实验室中，我们正在使用Illumina的通过合成测序。这意味着测序数据是通过合成每个碱基对获得的。让我们详细介绍该过程。

聚合酶附着

一旦我们将连接到流动池的克隆DNA簇，就会将测序试剂泵入其中。它们从流动池的一侧进入并在另一侧退出。将T4 DNA聚合酶冲入并附着在与流细胞结合的短DNA分子上。对T4聚合酶进行修饰，仅允许掺入一个碱基。

所有4个核苷酸都用特定的荧光团标记。如图1所示，胸腺胺的标记为绿色荧光团，胞嘧啶和蓝色的荧光团，鸟嘌​​呤红色的荧光团和腺嘌呤橙荧光团。这些核苷酸也经过修饰：它们具有3'帽，一次仅允许一次核苷酸添加。因此，在将一个核苷酸添加到底漆的3'端后，不再可以附着核苷酸。然后将任何剩余的自由浮动核苷酸从系统中洗掉。

图1.通过合成进行排序。聚合酶已连接到底漆后，将在底漆的3'末端添加带有特定荧光团的核苷酸。用3'盖修饰核苷酸，一次仅允许添加一个核苷酸。检测到由荧光团发出的荧光信号，并裂解3'帽，下一个测序循环开始。用荧光团标记的核苷酸

检测

由于所有核苷酸都用特定的荧光团标记，因此我们可以通过观察它们发出的荧光信号来识别核苷酸。例如，在图1中，我们可以观察到一个用A标记的核苷酸绿色在底漆的3'末端添加了荧光团。化学反应触发了绿色可以通过拍照记录的光。因为我们知道胸腺氨酸是用绿色荧光团标记的，所以我们可以将碱鉴定为胸腺嘧啶。每个周期结束时拍摄四张图片，记录每种可能的颜色。拍摄所有四张照片后，系统将覆盖它们。因此，我们可以轻松地识别每个群集的基本身份（请参见图2）。

图2。覆盖图像，每个颜色点代表一个克隆扩增的DNA簇。四种不同核苷酸的颜色代码：胸腺嘧啶，胞嘧啶，鸟嘌呤和腺嘌呤。

切割和去除

拍摄图片后，将核苷酸的3'盖切开，以便可以开始下一个测序循环。然后将切割的3'盖从系统中取出。这标志着测序周期的末尾，新循环可以从冲洗新的核苷酸回合并再次重复步骤开始。

测序后，图像被馈入计算机，并可以分析测序数据带有特定的软件。