La PCR è un metodo usato per preparare miliardi di copie di specifiche sequenze di DNA. Spesso è necessario avere un numero di copie della sequenza specifica di DNA maggiore di quello che si trova in un campione tipico per analizzare il DNA per la sua sequenza di coppie di basi o la sua lunghezza. Inoltre, la reazione di PCR è altamente specifica, il che significa che produrrà solo copie di una sequenza desiderata dal modello (campione) di DNA. Questa specificità è assicurata dai primer, che sono progettati per essere complementari e appaiarsi a regioni specifiche su ogni lato della regione di DNA di interesse (regione target). Queste caratteristiche rendono la PCR una tecnica potente da utilizzare, per esempio, nella genotipizzazione dei marcatori, prima del sequenziamento, o in vari test del DNA.

La PCR有限公司nsiste in tre fasi: 1. Denaturazione, 2. Ricottura e 3. Estensione. Le fasi vengono ripetute molte volte (spesso 30), producendo miliardi di copie di DNA di regioni specifiche.

Fasi della PCR

Per preparare miliardi di copie di DNA, vengono eseguiti molti cicli ripetuti di sintesi del DNA in una provetta PCR. Ogni ciclo include tre fasi distinte definite dalla temperatura (Figura 1). Tutti i cicli vengono eseguiti senza intervento in una macchina PCR, che può cambiare automaticamente la temperatura per creare le fasi.

1. Fase di denaturazione (95ºC): A questa alta temperatura, i legami idrogeno che tengono insieme i due filamenti di DNA si rompono, e i filamenti di DNA si separano. Il DNA a singolo filamento è ora disponibile per la copiatura.
2. Fase di ricottura (54ºC): A 54°C, brevi pezzi di DNA chiamati primer si legano ai siti complementari del DNA modello. I primer definiscono la sequenza target, cioè la regione specifica di DNA che sarà copiata. La temperatura di ricottura è calcolata dalla composizione del primer (il numero di nucleotidi e il numero di guanina e citosina). Normalmente, è necessario calcolare la temperatura di ricottura ottimale per ogni primer. In questo caso, consideriamo 54°C come temperatura di ricottura.
3. Fase di estensione (72ºC): A 72 ºC, un enzima chiamato DNA polimerasi è responsabile della copia del DNA. Riconosce l'estremità 3′ di un primer legato a un filamento modello e inizia a copiare il DNA modello.

Alla fine di un ciclo, le parti dei filamenti iniziali di DNA sono raddoppiate in numero. Alla fine, ad esempio, di 30 cicli, solitamente eseguiti nella PCR, almeno 1 miliardo (2³⁰) di copie della sequenza target sarà presente nella provetta. Per eseguire la PCR, è necessario aggiungere una DNA polimerasi termostabile, nucleotidi, primer e il DNA che si vuole usare come modello.

Reagenti PCR

• Primer:I primer si legano a una specifica sequenza di DNA e segnano l'inizio dell'amplificazione del DNA.
• Nucleotidi:I nucleotidi sono necessari per costruire la nuova sequenza di DNA.
• Polimerasi:La polimerasi è un enzima che assembla i nucleotidi sulla base della sequenza del template.
• DNA modello:Un modello è necessario per essere la base dell'amplificazione della nuova sequenza di DNA.

Quando si prepara un esperimento di PCR, bisogna fare molta attenzione alla potenziale contaminazione. La PCR è una tecnica molto potente per amplificare il DNA. Questo significa che se hai una piccola contaminazione (per esempio, DNA proveniente da un altro campione), anche questo DNA può essere amplificato, entrando in competizione con il modello originale e distruggendo i risultati del tuo esperimento. Per prevenire la contaminazione, devi sempre usare i guanti e lavorare in un ambiente molto pulito (cambia i puntali delle pipette quando stai pipettando da un altro contenitore, legati i capelli, non tossire o starnutire intorno al banco di lavoro della PCR, ecc.).

Replicazione del DNA

Primer