La réaction de polymérisation en chaîne, généralement siglé PCR (de l'anglaispolymerase chain reaction) est une méthode utilisée pour préparer des milliards de copies de séquences d'ADN spécifiques. Il est souvent nécessaire d'avoir un plus grand nombre de copies de la séquence d'ADN spécifique que celui que l'on trouve dans un échantillon typique lors de l'analyse de l'ADN pour sa séquence de paires de bases ou sa longueur. En outre, la réaction PCR est hautement spécifique, ce qui signifie qu'elle ne produira que des copies d'une séquence souhaitée à partir de l'ADN matrice (échantillon). Cette spécificité est assurée par les amorces, qui sont conçues pour être complémentaires et s'hybrider à des régions spécifiques de chaque côté de la région d'ADN concernée (région cible). Ces caractéristiques font de la PCR une technique puissante, par exemple pour le génotypage de marqueurs, avant le séquençage, ou dans divers tests ADN.
Les兵站de la PCR
Pour préparer des milliards de copies d'ADN, de nombreux cycles répétés de synthèse d'ADN sont effectués dans un tube PCR. Chaque cycle comprend trois étapes distinctes définies par la température (figure 1). Tous les cycles sont réalisés sans intervention dans une machine PCR capable de modifier automatiquement la température pour amorcer les étapes.
- L'étape de dénaturation (95ºC) : à cette température élevée, les liaisons hydrogène qui maintiennent ensemble les deux brins d'ADN sont rompues et les brins d'ADN se désagrègent. L'ADN monocaténaire est maintenant prêt à être copié.
- L'étape d'hybridation (54ºC) : à 54 degrés Celsius, de courts morceaux d'ADN appelés amorces se lient aux sites complémentaires de l'ADN matrice. Les amorces définissent la séquence cible, c'est-à-dire la région spécifique de l'ADN qui sera copiée. La température d'hybridation est calculée à partir de la composition des amorces (le nombre de nucléotides ainsi que le nombre de guanine et de cytosine). Normalement, vous devriez calculer la température d'hybridation optimale pour chaque amorce. Dans ce cas, nous considérons que 54 degrés Celsius est la température optimale.
- L'étape d'élongation (72ºC) : à 72 degrés Celsius, une enzyme appelée ADN polymérase est responsable de la copie de l'ADN. Elle reconnaît l'extrémité 3′ d'une amorce liée à un brin matrice et commence à copier l'ADN matrice.
À la fin d'un cycle, certaines parties des brins d'ADN initiaux ont vu leur nombre doublé. Par exemple, à la fin des 30 cycles généralement effectués en PCR, au moins 1 milliard (230) de copies de la séquence cible seront présentes dans le tube. Pour effectuer une PCR, vous devez ajouter une ADN polymérase thermostable, des nucléotides, des amorces et l'ADN que vous voulez utiliser comme matrice.
Les réactifs PCR
- Les amorces: les点火药se说明一个séquence d'ADN spécifique et marquent le début de l'amplification de l'ADN.
- Les nucléotides: des nucléotides sont nécessaires pour construire la nouvelle séquence d'ADN.
- La polymérase: la polymérase est une enzyme qui assemble les nucléotides sur la base de la séquence matrice.
- L'ADN matrice: une matrice est nécessaire pour servir de base à l'amplification d'une nouvelle séquence d'ADN.
Lorsque vous préparez une expérience de PCR, vous devez faire très attention à la contamination potentielle. La PCR est une technique très puissante pour amplifier l'ADN. Cela signifie qu'en cas de contamination mineure (par exemple, de l'ADN provenant d'un autre échantillon), cet ADN peut également être amplifié, entrant en compétition avec le modèle original et détruisant les résultats de votre expérience. Pour éviter toute contamination, vous devez toujours porter des gants et travailler dans un environnement très propre (changez les embouts de pipette lorsque vous prélevez dans un autre récipient, attachez vos cheveux, ne toussez et n'éternuez pas à proximité du plan de travail PCR, etc.).