Nel caso delqPCR, è molto importante evitare primer-dimer e altri prodotti non specifici della PCR perché incorporeranno il fluoroforo, portando a un'imprecisaquantificazione in esperimenti qPCR. Oltre alle soliteconsiderazioni quando si progettano i primer, ci sono alcune linee guida importanti per la progettazione di primer per la qPCR:

1) Scegliere primer che diano un prodotto (amplicon) di 100-200 bp (in modo ottimale 100 bp). La PCR funziona in modo ottimale per piccoli ampliconi di queste dimensioni. I primer dovrebbero essere lunghi circa 20 bp.

2) Se possibile, progettare primer che attraversino i confini esone-esone (in due esoni diversi) al fine di rilevare una possibile contaminazione del DNA genomico. Ma fai attenzione perché questi primer possono rilevare alcune varianti di splice, ma non altre. Se questo disegno non è possibile, è molto importante trattare il campione di RNA con DNAse prima della trascrizione inversa.

3) Controllare che la sequenza dei due primer non sia troppo complementare, per evitare che si leghino tra loro e formino primer-dimeri.