Die auf Restriktionsenzymen basierendemolekulare Klonierungist die „klassische“ Klonierungsmethode und immer noch eine der beliebtesten Techniken. Im Prinzip umfasst der Aufbau eines Plasmids die folgenden Schritte:
Restriktionsverdau:Geschlossenes zirkuläres Vektorplasmid und Fragment des fraglichen Gens werden mit einem oder mehrerenRestriktionsenzymengespalten.
Ligation:DNA-Fragmente mit kompatiblen Überhängen werden in ein linearisiertesVektorplasmidligiert.
Höhere Erfolgsquoten werden erzielt, wenn DNA-Fragmente mit 5'- oder 3'-klebrigen/überhängenden Enden verwendet werden, anstatt DNA-Fragmente mit stumpfen Enden zu assemblieren.