可以使用苯酚-氯仿法从细胞中提取DNA。这种方法可以产生包含数百万个基因的基因组DNA。为了从基因组DNA中分离出特定的感兴趣的基因,聚合酶链反应使用特定的引物可以应用。如果感兴趣的基因已被提供在载体中,特异性限制性内切酶可用于隔离。
用苯酚-氯仿法可以从细胞中分离出核酸。苯酚-氯仿是缓冲饱和苯酚与氯仿1:1的混合物。萃取的第一步是细胞裂解和水溶液均质。然后将苯酚-氯仿加入混合物中,形成两相,再通过离心分离。纯化苯酚的密度为1.07 g/cm3.氯仿的密度较高,为1.47 g/cm3.).因此,离心得到两种相:下层有机相和上层水相。
核酸从带负电荷的磷酸盐主链获得极性;因此,核酸可溶于上水相。蛋白质含有疏水区域,与苯酚相互作用,使蛋白质在两相界面沉淀(通常为白色絮凝)。脂质也有疏水区域,并将溶解在低有机相。混合物的pH值决定了核酸的分离。在中性pH下,RNA和DNA保留在上水相,而在酸性pH下,DNA移动到下有机相,RNA保留在上水相。最后一步,用异丙醇沉淀法从水相中回收核酸。
DNA产率(或DNA浓度)和纯度可以通过使用分光光度计测量吸光度来确定。NanoDrop分光光度计是一种利用留样系统可测定0.5-2 μl吸光度的分光光度计。样品保留系统,可以测量样品的高浓度而不稀释。吸光度测定在260纳米(A260)处,DNA吸收光最强。吸收的光的量与样品中DNA的量成正比。
这种关系可以用比尔-朗伯定律描述:c = (A * ε)/b
c:核酸浓度,ng/μL
A: AU的吸光度
ε: ng-cm/μL波长相关的消光系数
B:路径长度,单位为cm
双链DNA消光系数为50ng-cm/μL
在这种情况下,NanoDrop路径长度为10毫米
在λ = 280nm, λ = 230 nm, λ = 320nm处分别测定DNA纯度,并计算260/280nm, 260/230 nm, 260/320 nm的比值。核酸强烈吸收260 nm的光,酚和Trizol等有机污染物吸收230 nm的光,蛋白质吸收280 nm的光。核酸和蛋白质都不吸收320纳米的光。
260/280的比值约为1.8,一般认为是纯DNA,而纯RNA的比值约为2。对于260/320,1.8-2.2的比值一般表示核酸样本为纯。对于260/230,比值<1.8表示有机污染物的显著存在。