“画像ilustra las microesferas densamente ag)lutinadas dentro de una columna, como se muestra en la primera imagen circular. Si ampliamos la imagen hasta apreciar las microesferas de manera individual, como se muestra en la segunda imagen circular, se puede ver el material que recubre la superficie de las microesferas.
La columna es una parte fundamental del sistema HPLC, ya que es donde tiene lugar la separación de los analitos. La columna está llena de microesferas de sílice que pueden ser recubiertas. Es el material superficial que recubre las microesferas el que determina la polaridad. Las microesferas de sílice son polares por naturaleza, pero cuando se recubren con largas cadenas de carbono se convierten en no polares. Debido a que las microesferas dentro de la columna son estacionarias durante el proceso, también se les denomina fase estacionaria.
En la fase inversa, la fase estacionaria presente en la columna es no polar. Por lo tanto, los analitos no polares interactuarán con la columna y permanecerán más tiempo en ella, abandonando la columna más tarde que los compuestos polares.
Tipos de interacciones
Existen cuatro tipos de interacciones: interacciones no polares, interacciones polares, interacciones iónicas e interacciones basadas en el tamaño molecular.
Por lo general, las microesferas en columnas están compuestas de sílice o algún polímero. A la estructura se pueden adherir múltiples tipos de cadena, proporcionando diferentes tipos de interacciones:
Interacciones basadas en la polaridad:los compuestos polares serán retenidos por fases estacionarias con cadenas polares, como -CN o -OH. Los compuestos no polares serán retenidos por los grupos no polares en la fase estacionaria, como -C8 o -C18.
Interacciones iónicas:dependiendo del pH, algunos grupos pueden ser protonados o desprotonados, formando especies iónicas. Si el analito y la fase estacionaria tienen cargas opuestas, los analitos serán retenidos en la columna.
Tamaño molecular:Las moléculas pequeñas pueden ser retenidas en los poros de la fase estacionaria, mientras que las moléculas grandes no quedarán atrapadas. Por lo tanto, las moléculas pequeñas permanecerán más tiempo en la columna, mientras que moléculas grandes pasarán más rápido.
Técnicas de separación
En función del tipo de interacciones presentes entre los analitos y la fase estacionaria, podemos encontrar dos técnicas principales de HPLC:
HPLC de fase inversa:basada en interacciones no polares. Los compuestos no polares se mueven más lentamente en la columna que los compuestos polares.
HPLC de fase normal:basada en interacciones polares. En la comuna, los compuestos polares se mueven más lentamente que los no polares.
Otras dos técnicas son la cromatografía de intercambio iónico (basada en las interacciones iónicas entre los analitos y las resinas cargadas positiva o negativamente) y la cromatografía de exclusión por tamaño (basada en el tamaño molecular de los analitos).
Escala de polaridad
La polaridad de una molécula se puede comparar con la de otra molécula. Una molécula puede ser, por un lado, más polar cuando se compara con otra molécula, pero también puede ser, por otro lado, menos polar. Se puede decir que la polaridad tiene su propia escala. Por ejemplo, el CN es más polar que el C8, pero menos polar que la sílice.
Escala de polaridad para la fase estacionaria.
