基于CRISPR-Cas分子机制, CRISPR-Cas技术可以用来生成淘汰赛细胞通过使用正确的CRISPR-Cas组件: Cas9核酸内切酶作为Cas蛋白和靶向被编辑基因的gRNA序列。
一旦进行了CRISPR实验,为了确认所选的基因被正确地敲除,需要遵循四个主要步骤:
选择阳性克隆,制作稳定的细胞系:这一步依赖于在细胞培养中添加抗生素。插入细胞的质粒含有一个片段,可以对特定的抗生素产生抗性。在几天的时间里加入抗生素,只有含有质粒的细胞才会对抗生素产生抗药性。选择不同的克隆进行进一步分析是一个常见的过程。
从选定的克隆体中放大感兴趣的区域:一旦稳定的克隆被选择,进行PCR扩增目标DNA区域。对基因组DNA进行PCR是很重要的,如果基因被成功敲除,它就不会被表达。因此,这一步不建议进行RNA提取及后续RT-PCR。
对放大区域进行排序:为了确保DNA序列发生了变化,应对扩增后的DNA进行测序,以评估在DNA测序过程中插入了何种类型的突变NHEJ过程.
重复检测方法观察所选基因的表达以及细胞的表型是否有变化:这可以通过免疫荧光、细胞分选或免疫印迹来实现。
如果细胞被正确地敲除,所选基因的功能应该被改变或完全丧失。