Certains paramètres importants en chromatographie sont expliqués dans cette section. Ils sont utiles pour interpréter le chromatogramme qui est une représentation de l'intensité du signal traité en fonction du temps.
La résolution (R)
Lorsque deux pics apparaissent dans le chromatogramme, il est utile de calculer la résolution des deux pics (R), qui donne une idée de la qualité de la séparation des deux analytes. Elle doit normalement être supérieure à 1,5 pour une bonne quantification.
R peut être mesuré en comparant le temps de rétention à la largeur du pic, comme indiqué dans la première équation, ou en utilisant d'autres paramètres ( le nombre théorique de plateaux, la sélectivité et le facteur de capacité), comme indiqué dans la deuxième équation.
R représente la résolution, tRest le temps de rétention, w est la largeur du pic, N est le nombre théorique de plateaux, α représente la sélectivité etk' est le facteur de capacité.
D'après la première équation, B est l'espèce dont le temps de rétention est le plus long, et tRet W sont respectivement le temps de rétention et la largeur du pic d'élution.
Le facteur de rétention ou le facteur de capacité (k')
Le facteur de rétention (également appelé facteur de capacité) indique dans quelle mesure un analyte est retenu. Il est calculé à partir du temps de rétention (tR) et du temps de maintien (tM). Le temps de rétention est le temps nécessaire à l'échantillon pour atteindre le détecteur après l'injection. Il mesure donc le temps dont les composés non retenus ont besoin pour atteindre le détecteur. L'expression peut également être écrite en fonction du temps de rétention relatif (t'R). Il s'agit du temps nécessaire à l'analyte pour atteindre la colonne après les composés non retenus.
Si la constante de distribution est indépendante de la concentration du composant de l'échantillon, alors le facteur de rétention (k') est également égal au rapport des quantités d'un composant de l'échantillon dans les phases stationnaire et mobile respectivement, à l'équilibre :
Le temps de rétention (tR)
Le temps de rétention (tR) est le temps nécessaire à chaque analyte pour passer de l'injecteur au détecteur. Il est normalement calculé à partir du moment de l'injection (t=0) jusqu'au maximum du pic, lorsque la plupart des molécules atteignent le détecteur (t=tR) indiqué par le point le plus élevé du pic.
Ce temps de rétention dépend de l'affinité entre l'analyte et la phase mobile et stationnaire. Plus l'analyte interagit avec la phase stationnaire, plus le temps de rétention est long. En revanche, plus l'analyte interagit avec la phase mobile, plus il sera élué rapidement. et plus le temps de rétention sera court.
La sensibilité
L'intensité du signal de chaque analyte est proportionnelle à sa concentration. Plus la concentration est faible, plus le signal est faible. Il est donc important de savoir quelle est la concentration la plus faible de l'analyte pour obtenir un signal qui puisse être distingué de la ligne de base. Si la concentration dans un échantillon inconnu est inférieure à cette limite, nous ne pouvons pas le détecter, même s'il est présent dans l'échantillon.
La sélectivité (α)
La sélectivité est une mesure de la différence relative de rétention. Elle est mesurée en comparant les différents facteurs de rétention (k'). La valeur de la sélectivité doit être supérieure à 1 pour que la séparation se place.
数量的orique de plaques (N)
L'efficacité de la colonne peut être mesurée par le nombre théorique de plateaux (N). Il s'agit d'une mesure de l'élargissement relatif du pic (ou largeur du pic) pour un analyte en cours de séparation. Le nombre théorique de plateaux est mesuré en comparant le temps de rétention (tR) et la largeur du pic (w). Il y a 2 formules que l'on peut utiliser pour mesurer le nombre théorique de plateaux, en fonction de si vous connaissez la largeur du pic (w) ou la moitié de la largeur du pic (w1/2).
Un nombre de plateaux plus élevé produit des bandes plus nettes et plus étroites, ce qui permet une meilleure détection et une meilleure capacité de résolution des pics pour les échantillons complexes. Le nombre théorique de plateaux augmente lorsque l'on utilise une taille de billes plus petite. L'utilisation d'une taille de billes plus petite présente également des avantages, comme l'amélioration de la résolution et la réduction du temps d'exécution. Cependant, l'utilisation d'une taille de bille plus petite entraîne une pression plus élevée.
L'analyse des données
Lorsque vous injectez un échantillon contenant plusieurs analytes, vous aurez plusieurs pics sur votre chromatogramme. Si ce n'est pas le cas, cela signifie que la séparation des molécules n'était pas assez bonne. Dans ce cas, vous devez modifier certains paramètres (la phase mobile, la phase stationnaire, la température, le débit) pour obtenir la séparation souhaitée.
如果分离是好的(la分辨率配角rieure à 1,5), vous pouvez identifier quel pic correspond à chaque molécule.Pour cela, il faut penser à la composition de votre phase stationnaire (polaire ou non polaire ?) et voir si vos analytes sont plus ou moins polaires.