El típico instrumento de HPLC consta de varios componentes importantes. Estos componentes tienen funciones específicas y se necesitan entre sí para poder llevar a cabo un experimento de HPLC correctamente.
Los principales componentes de la HPLC se enumeran a continuación:
- Depósito de fase móvil→ Aquí es donde se encuentra la fase móvil. La fase móvil se almacena normalmente en botellas de cristal.
- Bombas→ La función de la bomba es generar alta presión y originar un flujo de fase móvil en el sistema.
- Inyector de muestra→ Aquí es donde se introduce la muestra en el sistema. La muestra debe estar en forma líquida (solución).
- 科鲁姆纳→ Aquí es donde tiene lugar la separación de la muestra. La columna está llena de microesferas que se denominan fase estacionaria.
- Horno termostatizado→ Aquí es donde se aloja la columna y en donde se puede controlar la temperatura.
Detector→ Aquí es donde los analitos separados son identificados y cuantificados.
Adquisición de datos→ Por lo general, se utiliza un ordenador para procesar los datos recopilados en el detector. El resultado de los datos se puede presentar en forma decromatograma.
Iniciando el instrumento de HPLC
Hay varios pasos que debes realizar antes de poder ejecutar tu experimento de HPLC. A continuación, se resumen los pasos principales:
- Preparación de la muestra:
Solo se pueden introducir muestras líquidas en el sistema HPLC. Por lo tanto, se requiere un pretratamiento de la muestra para limpiar las interferencias y/o disolver los analitos en un disolvente. Por lo general, se suelen utilizar tres técnicas para eliminar las interferencias: extracción, filtración y centrifugación.
Cuando la muestra es sólida, necesitamos procesar la muestra desde un estado sólido a una solución homogénea. Podemos empezar por machacar la muestra para hacerla polvo, utilizando un mortero y un pilón. Luego podemos disolver la muestra en polvo en una solución. Para eliminar los grumos de la muestra que no están bien disueltos, podemos pasar la solución por un filtro fino (normalmente un filtro de 0,5 μm). Ahora podemos estar seguros de que nuestra muestra es una solución homogénea y de que está lista para inyectarse en el instrumento de HPLC.
- Acondicionamiento del sistema:
Es重要acondicionar拉一列圆柱,en la曲e se ejecuta cualquier análisis. Esto se hace encendiendo la bomba y seleccionando el caudal y la temperatura. A continuación, solo hay que esperar a que la presión del sistema sea constante. Esto significa que la fase móvil ha alcanzado cada uno de los poros de la columna, activando sus microesferas, y que el sistema está listo para la inyección de la muestra. A la fase móvil le llevará algún tiempo activar todas las microesferas. Durante este período, el caudal y la presión son inestables.
Es muy importante tener exactamente las mismas condiciones cuando se realizan varios experimentos y se desea compararlos, razón por la cual el acondicionamiento del sistema es un paso clave. Deberás repetir este paso cuando se mide con otra fase móvil o estacionaria. Cuando cambies la fase móvil, también deberás lavar los tubos (que conectan el depósito de la fase móvil con la columna) y asegurarte de que no queden restos de la fase móvil empleada con anterioridad.
- Curva de calibración:
La curva de calibración indica las concentraciones de la muestra en el eje x y el área bajo la curva en el eje y.
para poder desiginar la la la los anaalitos en la muestra，se necesita una una curva decalibración。Esto se Hace Midiendo Varias soluciones con Conconcidas einyectándolasen el Sistema。continuación，Puedes比较laconcentaciónconocida con el Cromatogramaudrante；Eláreadel pico，TambiénConocidacomo Area bajo la Curva，Es Proporcional a lacompentacióndela Muestra。Cuanto市长SeaElárea，塞拉·拉普斯科翁市长。tambiénPuedesobservar el eltiempo de retencióno el tiempo concreto que tarda la muestra en recorrer la columna y ser registrada en el detector. Estetiempo de retenciónes específico del compuesto. Cuando ejecutas una mezcla de muestras que contiene varios compuestos diferentes, puedes identificar los compuestos basándote en sutiempo de retención.
La curva de calibración se prepara midiendo varias concentraciones y creando una recta. Estas concentraciones incluyen una concentración que es a la vez menor y mayor que la concentración esperada del analito en la muestra real. Cuando no conozcas la concentración del analito en la muestra real, por lo general, prepararás una curva de calibración utilizando un mínimo de ocho concentraciones de muestra diferentes. Cuando conoces la concentración esperada del analito en la muestra real, puedes reducir el número de concentraciones de muestra necesarias para la curva de calibración.