连接酶，过程是manière共同的ADN双布林的小磷酸盐，即effectuée一种酶appelée ADN连接酶。L'ADN连接酶utilisée在生物技术实验室，一个噬菌体T4的été isolée à部分大肠杆菌．两种催化剂réactions和manière相似，但两种催化剂diffèrent是辅因子。L 'enzyme大肠杆菌这是一种解脱+阿洛斯que l'enzyme t4 a besoin d'atp。CES Cofacteurs Sont Fournis Dans Le Tampon。
LaRéactionde ligature
La réaction de ligature se compose généralement de deux étapes:
La Collision desExtrémitésd'Adn。Cette Collision Se Produit Parard et SaFréquenceest加上美族àbassetempérature。La BasseTempérationStavilizeLaLiaisonHydrogèneTenreLESNucléotides的Compansmentses。L'Adn Ligase Attint UneActivitéSoluealeà25O.．enRègleGénérale，加上LaTempératured'VesvateBasse，Le Temps d'孵化Est。
La enzymatique反应。L' adn连接酶催化连接中心le 3'-羟基和le 5'-磷酸。
反应de结扎。Le nucléotide AMP est transféré au 5'-磷酸盐。Ensuite, la liaison amp -磷酸盐attaquée par 3'-OH为一个连接共价全部在libérant l' amp。
L'efficacité d'une réaction de ligature peut être augmentée en optimisant le rapport插入/向量。《和谐》3:1是《bon》paramètre《départ》。浓度的向量和n可以插入être mesurée à然后spectrophotomètreNanodrop．La FormuleNécessaire倒入CalculerLaultiTédeGèned'Tinérêt（插入）àAjouterDansLaRéanctiondeLiegatureStlaSuivante：
例如réaction de ligature的计算优化:
数据
LesRésultatsde la Mesure AuSpectophomètreSont：
载体浓度ADN: 30ng /μL
l'insert浓度:15ng /μL
我们可以également到données根据向量和插入物的长度，分别是4 000 pb和1 000 pb。最优关系是3:1。我们可以用向量和n。
计算专家
(ng du vecteur x taille en KB de l'insert) / taille en KB du vecteur x insert/ vector = ng d'insert
- (60 ng x 1 kb) / 4 kb x 3/1 = 45 ng d'insert
| 合成de la réaction | 浓度réaction | 体积 | ||
|---|---|---|---|---|
| 卫生棉条结扎10x, ADN连接酶T4 | 1 x | 20 μL / 10x = 2 μL | ||
| 为了与 | 60 ng | 60ng / 30ng / μL = 2 μL d'insert | ||
| 与连接酶T4 | 1统一 | 1μL | ||
| 全部的 | 20μL |
为了说明plasmidique
表达大陆的基因位点是克隆的，一个代理sélection spécifique，一个起源réplication，一个opérateur和一个推广堡。
质粒在molécules染色体外，质粒在à双布林，质粒在fermées manière共价和循环。1 kb à加上200 kb。所有的质粒都不是载体。一个molécule告诉质粒caractéristiques为gènes克隆的载体提供服务。它存在généralement两种类型的向量在功能上的应用:克隆向量和表达式向量。两个序présentent原理caractéristiques序posséder:一个序和多个序网站的序gène。但是我们可以把它表达成一个caractéristique supplémentaire:一个推广者堡utilisé pour exprimer une protéine étrangère codée但是gène d'intérêt。表达式的向量可以包含opérateur和régulateur的表达式génique。L'opérateur是一个片段，它是转录的一个因素。克隆原理的向量utilisés倾注波特和乘数gène d'intérêt。
一个sélection spécifique的代理人utilisé肯定会让我们hôte保存质粒。一个来源是réplication质粒和capacité细胞的倍增器indépendamment du染色体hôte的原理。
组合des质粒
原则上，质粒的组合是étapes suivantes:
质粒载体循环fermé和片段du gène d'intérêt sont clivés在限制酶中。
Le gène d'intérêt est ligaturé au质粒载体linéarisé。
质粒是transformé en hôte approprié。
Différentes限制酶可防止générer悬挑相容性。
On Etinent Un TauxdeRéussitePlusÉlevéDansL'Assemblage Des Plasmides En Utilisant Un Fragment D'Adn Avec desExtrémités5'OU 3'抗议/分拣体PlutôtQu'AvecdesExtrémitésFranches。L'Adn Ligase Relie Deux碎片D'Adn Avec UneExtrémitéStoratante兼容。UN碎片D'ADN Avec UneEutherémitéStoratanteparticulièrepeutêtreligaturé不受缓冲Au片段qui aétédécoupéaveclamêmeenzyme de限制，Maisaussiàtout片段Avec desExtrémitésponatiblesgénéréespar d'autres enizymes de限制。
我们可以确定质粒的组合séquençage de l'ADN。最重要的是要确认在质粒载体和构象以及讲座干部中插入的连接。Un déphasage我们可以用entraînent表达protéines的非功能函数来进行突变或模拟。