모든 세포에서 모든 유전자가 끊임없이 발현되는 것은 아닙니다. 세포는 인코딩된 단백질을 생산하기 위해 DNA 서열을 mRNA로 전사해야 합니다. 따라서, 유전자 발현 수준은 mRNA 수준에 상응합니다. 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 사용하여 유전자 발현을 측정할 수 있습니다. RT-PCR은 다은과 같은 단계로 이뤄집니다.
역전사 효소를 이용하여 RNA를 cDNA로 변환
PCR을 이용하여 cDNA 확장
그림 1. mRNA 템플릿으로 cDNA를 생성하는 단계.mRNA는 소량(dT)의 프라이머를 사용하여, cDNA로 역전사된 후, RNA 가닥을 가수분해합니다.
信使核糖核酸DNA보는다연약하고PCR을통해확장될수없습니다。이런이유로, mRNA는 상보적 DNA(cDNA)로 변환됩니다. cDNA는 메신저 RNA 분자에서 합성된 DNA입니다. cDNA 합성은 DNA 합성에 RNA를 템플릿으로 사용하며, 역전사라고 하는 효소를 통해 촉진됩니다. 역전사는 초기에 발견되었고 레트로 바이러스에서 고립되었습니다. 이러한 바이러스에는 RNA 게놈이 있습니다. 그러므로 바이러스는 숙주 세포의 분자 기계류와 호환되기 위해 그 게놈의 cDNA 복제를 생산해야 합니다.
RT-PCR 반응 단계는 다음과 같습니다.
역전사는 cDNA 가닥을 합성하는 데 RNA를 템플릿으로 사용합니다.
온도를 높이면 RNA-cDNA 혼성체가 분리됩니다.
특정 유전자 프라이머는 그 상보적 배열순서로 강화됩니다.
DNA 중합효소는 프라이머 결합 부위에서 시작하여, 상보적 DNA 가닥을 생산합니다.
온도를 높이면 가닥이 분리되고 PCR 주기가 반복됩니다.
RT-PCR 반응이 끝날 때, 유전자가 발현되는 경우 수십억 개에 달하는 대상 유전자가 복제됩니다.
겔 전기 영동법으로 DNA 복제의 양을 시각화할 수 있습니다.