磷酸化是指添加一个磷酸基。在底物水平磷酸化的情况下，磷酸基从代谢途径的中间反应物中去除，反应的自由能被用来添加第三个磷酸到可用的ADP分子中，产生ATP(见下图)。

在细胞呼吸这种情况发生在糖酵解和克雷布斯循环．

在底物水平的磷酸化反应中，中间反应物的磷酸基被转移到ADP分子上合成ATP。