连接，这是一个共价连接双链DNA的磷酸主干的过程，是由一种称为DNA连接酶的酶来完成的。生物技术实验室常用的DNA连接酶是从T4噬菌体或噬菌体中分离出来的大肠杆菌．它们都以相似的方式催化连接反应，但它们的辅因子需求不同。的大肠杆菌酶需要NAD+而T4酶需要ATP。这些辅因子在缓冲中提供。
结扎反应
连接反应一般包括两个步骤:
DNA末端碰撞。这种碰撞是偶然发生的，在低温下发生的概率较低。低温稳定了互补核苷酸之间的氢键。DNA连接酶在25℃时达到最佳活性o．一般的规律是培养温度越低，培养时间越长。
酶促反应。DNA连接酶催化3'-羟基与5'-磷酸之间的连接。
结扎的反应。AMP核苷酸转移到5'-磷酸上。然后AMP-磷酸键被3'-OH攻击，在释放AMP的同时形成共价键。
通过优化插入物与载体的比例，可以提高连接反应的效率。比率为3:1是一个很好的初始参数。DNA载体和插入物的浓度可以用分光光度计等方法测定Nanodrop．计算在结扎反应中加入的感兴趣基因(插入)数量所需公式为:
连接反应优化计算示例:
数据
分光光度计的测量结果如下:
DNA载体浓度:30 ng/μL
插入浓度:15ng /μL
我们还得到了4000 bp和1000 bp的矢量和插入长度的数据。最佳比例为3:1。我们将使用60 ng的DNA载体。
计算
(ng vector x KB size of insert)/ vector x insert/vector = ng of insert
- (60ng × 1kb) / 4kb × 3/1 = 45ng的插入
| 反应组件 | 反应浓度 | 体积 | ||
|---|---|---|---|---|
| 10x连接缓冲，T4 DNA连接酶 | 1 x | 20 μL/ 10x = 2μL | ||
| DNA向量 | 60 ng | 60 ng / 30 ng / L = 2μμL插入 | ||
| T4 DNA连接酶 | 一个单位 | 1μL | ||
| 总计 | 20μL |
质粒载体
表达载体包含多个克隆位点、一个可选择的标记、一个复制起点、一个操作符和一个强启动子。
质粒是DNA的染色体外分子，多为双链、共价闭合和环状分子。它的大小从1 kb到超过200 kb不等。并不是所有的质粒都是载体。像质粒这样的DNA分子需要具备一些特性，才能作为基因克隆的载体。根据应用的不同，一般有两种载体:克隆载体和表达载体。这两个载体都具有载体应有的主要特征:可选择的标记基因、复制起点和多个克隆位点。但是表达载体有一个额外的特征，那就是强启动子，因为它被用来表达感兴趣基因中编码的外源蛋白。表达载体可以包含作为基因表达调节剂的操作符。转录因子是DNA中与转录因子结合的一段。克隆载体主要用于携带和复制感兴趣的基因。
一个可选择的标记被用来确保宿主载体保留特定的质粒。复制的起源使质粒能够独立于主寄主染色体在细胞内增殖。
质粒的组装
原则上，质粒组装包括以下步骤:
封闭的环状载体质粒和感兴趣的基因片段被一种或多种限制性内切酶切割。
目的基因被连接到线性化的载体质粒。
得到的质粒被转化为适当的宿主。
不同的限制性内切酶可以产生亲和性突出物。
与钝端DNA片段相比，5'或3'粘/悬端DNA片段组装质粒的成功率更高。DNA连接酶用相容的悬垂连接两个DNA片段。具有特定悬垂的DNA片段不仅可以连接到用相同限制性内切酶切割的片段上，也可以连接到任何由其他限制性内切酶产生的末端相容的片段上。
质粒组装的确认可以通过DNA测序来确定。重要的是要确认插入物已成功连接到质粒载体与正确的构象和阅读框。帧的移动可能导致无意义或误义突变，从而导致非功能性蛋白的表达。