基于限制性内切酶分子克隆是“经典”的克隆方法，仍然是最受欢迎的技术之一。原则上，质粒组装包括以下步骤:
限制消化:封闭圆形载体质粒和目的片段的基因被一个或多个剪切限制性内切酶．
结扎:具有相容性的外悬的DNA片段被连接成线性化载体质粒．
使用具有5'或3'粘性/悬垂末端的DNA片段比使用钝性末端组装DNA片段成功率更高。