分子克隆

分子克隆技术是现代生物技术发展的基础技术之一。这项技术在20世纪80年代首次使用，它允许将人类的胰岛素基因插入酵母和大肠杆菌中。这使得微生物能够产生胰岛素，而胰岛素是治疗糖尿病的主要药物。从那时起，分子克隆和基因工程已经成为从医药生产、生物乙醇生产到基础研究的最基本的技术之一。在分子克隆实验室，您将学习如何组装包含RAD52和GFP的表达载体。目的是用多西林控制RAD52的表达水平，并通过观察GFP信号来监测其表达水平。

向量组装

在分子克隆实验室的第一部分，您将学习如何从酵母细胞提取DNA，并限制从另一个载体DNA中的酶分离。首先，您将准备提取的DNA和浓度，然后，您将组装一个载体包含感兴趣的基因(RAD52)和GFP使用正确的连接酶，缓冲液和孵育温度。

转换

通过电穿孔将组装好的载体转化为酵母细胞。RAD52基因的表达受一个基因调节器的调控。在培养基中加入多西林后，RAD52基因将被沉默。GFP作为RAD52的报告基因，RAD52活性的细胞也会表达GFP，而RAD52沉默的细胞则不会表达GFP。GFP信号是通过将细胞暴露在蓝光下来监测的。

DNA损伤和修复系统

RAD52被假设在DNA修复中扮演重要角色。您将进行一项实验，比较表达RAD52的细胞和沉默RAD52的细胞通过紫外线辐射诱导DNA损伤的结果。如果RAD52在DNA修复中很重要，那么沉默的RAD52细胞将无法在紫外线辐射治疗中存活。总而言之，分子克隆实验室将向您介绍分子克隆技术和报告基因，并让您了解DNA损伤和DNA修复系统。